侧流胶体金免疫试纸快速测定牛奶中泰乐菌素（完整文档）

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　侧流胶体金免疫试纸快速测定牛奶中的泰乐菌素

　 大环内酯类抗生素是非常重要的一类抗菌化合物，广泛用于人类和兽医的治疗和预防[1]。泰乐菌素(tylosin，TYL)是最常用的预混大环内酯类抗生素，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、支原体、巴斯德氏菌以及衣原体具有很高的活性[2]。它们被广泛用于动物生产中，以预防和治疗家畜的肠道和呼吸道感染[3-4]。滥用抗生素可能会在可食用的动物组织和牛奶中留下残留物，对消费者健康造成不利的影响。因此，许多国家禁止在饲料添加剂中使用 TYL，它于 1998 年在欧盟被禁止。在中国，可食用动物组织中 TYL 的最大残留限量(maximum residue limit，MRL)规定为 50 μg/kg(牛奶)和 200 μg/kg(肌肉组织)[5]。牛奶中 TYL 的 MRL 也是巴西农业、畜牧和食品供应部在牛奶中 TYL 残留法规中采用的 MRL。这与欧盟和美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)要求的 MRL一致[6-7]。为了评估 TYL 的残留量，需要灵敏的分析方法以确保低浓度下的测定。文献揭示了几种测定肌肉组织中 TYL 残留的方法，如HPLC[8-9]、薄层色谱[10]、LC-MS/MS[11-12]和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析[13]。尽管这些方法准确可靠，但它们昂贵，预处理(尤其是提取和纯化)复杂且耗时，因此不适用于现场测试或常规分析的高通量分析筛查[14]。从实践的角度来看，开发一种简单，低成本，省时的筛选技术至关重要[15]。

　自 1980 年初期发展以来，侧流免疫层析测定技术已获得广泛认可[16]，其受欢迎的主要原因是测试设计的简单性。侧流免疫层析测定装置紧凑且易于携带，大多数不需要外部试剂即可获得结果，添加液体样品将启动并完成测试，结果快速且易于解释，通常无需借助仪器，检测试纸条的制造相对容易且便宜。近年来，侧流免疫层析试纸被用作检测激素[17]、病毒(艾滋病毒、乙肝和丙型肝炎、新冠病毒)[18-20]、细菌[21]和寄生虫等抗原的流行诊断工具[22]。对于较小的分析物，可以使用竞争性 ELISA 测定[23]，检测试剂通常是针对分析物的胶体金标记抗体。捕获线通常是与固定在膜上的载体蛋白缀合的分析物。样品中的分析物将与固定在膜上的分析物竞争，从而与检测抗体结合。样品中存在的分析物越多，它将越有效地阻止胶体金标记抗体的捕获。因此，样品中分析物数量的增加将导致读出区域中信号的减少[24-25]。到目前为止，竞争性剥离测试主要用于检测小分子物质(半抗原)，尤其是在动物饲养中滥用的药物。这种竞争性测定的检测极限可以达到 ppb 水平(每克样品分析物的纳克级数)。

　在这项工作中，针对 TYL 的免疫原，产生了 TYL 的特异性单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAb)。在此基础上，开发了一种单步免疫色谱测试条，用于检测牛奶中的 TYL 残留性。

　1 材料与方法 1.1 材料与试剂 氯金酸和酪蛋白，American Sigma Company；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，American Amresco Company；辣根过氧化物

　酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，American Jackson Laboratory；聚氯乙烯(polyvinyl chloride，PVC)塑料片、血液滤过膜、吸收纸，上海金标生物技术有限公司；硝酸纤维素(nitrocellulose membrane，NC)膜，American Millipore Company。

　1.2 仪器与设备 Forma 371 Steri-Cycle 酶标仪，Thermo Fisher；XYZ Biostrip 分配器、CM 4000 切割机，美国加利福尼亚州 Bio-Dot。

　1.3 免疫原的偶联 通过碳二亚胺法制备该程序中的 TYL。将 5 mg 的 TYL 溶解在磷酸盐缓冲液(phosphate buffer，PBS，pH 7.0)中，然后加入 10 mg 的碳二亚胺化合物。将混合物在黑暗中于 4 ℃搅拌约 6 h。将 BSA 或卵清蛋白(ovalbumin，OVA)溶解在 PBS 缓冲液中，并加入混合物中。TYL与 BSA 或 OVA 的摩尔比为 25∶1。将免疫原 BSA-TYL(OVA-TYL)在室温下搅拌过夜，并用 PBS 透析约 3 d[26]。通过紫外光谱和 SDS-PAGE分析免疫原。免疫原在-20 ℃的条件下保存。

　1.4 单克隆抗体生产 用 3 种免疫原中的每一种免疫 5 只雌性 BALB/c 小鼠(6 周龄)(每只小鼠的剂量为 50 μg 蛋白)，以产生 mAb。每 2 周使用弗氏完全佐剂中的免疫原乳剂对小鼠进行皮下免疫。第三次免疫后从每只小鼠收集血清，并通过 ELISA 监测抗体滴度。处死具有最高抗体滴度的小鼠，并使用SP2/0骨髓瘤细胞融合脾细胞。融合的细胞在HAT培养基中繁殖。

　融合后，使用 HAT 培养基针对选择未融合的细胞。在选择融合细胞之后，将 HAT 培养基替换为 HT 培养基。使用非竞争性间接 ELISA 筛选生长中的杂交瘤细胞中抗体的产生。通过有限稀释法将产生针对 TYL的特异性 mAb 的杂交瘤亚克隆 2 次。收集亚克隆的杂交瘤细胞，离心并在液氮中冷冻[20]。用饱和硫酸铵沉淀法纯化杂交瘤小鼠的腹水，并用于间接竞争 ELISA(icELISA)。

　1.5 间接竞争 ELISA 微量滴定板的每个孔均涂有 100 μL 包被抗原。将板在 4 ℃下孵育过夜，然后用 200 μL 封闭缓冲液(0.01 mol/L 含 50 g/L BSA 的 PBS)封闭。随后将 50 μL 最佳抗体稀释液和 50 μL 具有连续稀释度的TYL 标准液添加到孔中，并将滴定板在 37 ℃下孵育 30 min。洗涤后再加入 100 μL 稀释的山羊抗小鼠 IgG-HRP 溶液，并将板在 37 ℃下孵育 30 min。洗涤后，加入 100 μL 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)底物(在 0.05 mol/L 柠檬酸缓冲液中，pH 4.5 的 10 g/L TMB 和 H2O2)，在 37 ℃ 孵育 10 min后，反应用 2 mol/L H2SO4 终止反应。然后，用在 450 nm 处测量吸光度 OD450 值。为了间接比较不同的校准曲线，将 OD450 值转换为相应的测试抑制率，如公式(1)所示：

　测定抑制率 (1) 式中：B，OD450 值；B0，非竞争性抗原 OD450 值；Bck，阴性对照 OD450值。

　1.6 胶体金标记单克隆抗体的制备 通过用 10 g/L 柠檬酸钠控制还原氯化金来制备平均直径为 15 nm 的胶体金。简而言之，将 50 mL 的 0.1 g/L 氯化金三水合物的超纯水溶液(Millipore，美国)加热至沸腾，然后在搅拌的同时添加 1 mL 的10 g/L 柠檬酸钠溶液。颜色从浅黄色变为亮红色后，将溶液再煮沸 5 min，以完成氯化金的还原。用碳酸钠(0.2 mol/L)将胶体金溶液的pH 值调节至 9.0。通过以下步骤确定最佳的蛋白质标记浓度[27]：将25 μL 抗-TYL mAb 溶液与 25 μL 胶体金溶液混合。将混合物在室温下孵育 15 min，然后添加 100 μL 的 100 g/L NaCl 溶液。用于胶体金标记的 mAb 的最佳浓度是不改变颜色的最低 mAb 溶液浓度。在 20 mmol/L 硼酸钠(pH 9.0)中加入 1 mL 100 g/L BSA 溶液后，将混合物在室温下再孵育 10 min，然后在 10 ℃下通过重复离心(25 000×g)洗涤标记的 mAb 用含有 10 g/L BSA 和 1 g/L 叠氮化钠的 20 mmol/L硼酸钠(pH 9.0)处理 30 min。沉淀物重悬在洗涤缓冲液中，并保存在 4 ℃以便使用[20]。

　1.7 TYL 试纸条的组装 免疫层析卡包括样品垫、共轭垫、NC 膜、吸收垫、PVC 底板以及检测线和质控线，并在其两端覆盖有彩色膜。TYL 与 BSA 连接，然后用作检测线捕获试剂(BSA-TYL)。将山羊抗小鼠 IgG 用作捕获试剂，在 NC膜上进行测试。金标抗体用量按照上述优化后的条件加入 96 孔板的微孔，在 40 ℃下干燥 1 h 后，将膜密封并在室温下在干燥条件下贮存。通过用 20 mmol/L 含 87.5 g/L 蔗糖，87.5 g/L BSA，0.6 mol/L

　NaCl 的硼酸钠缓冲液(pH 8.0)将胶体金标记的 mAb 稀释为 TYL 制备缀合物溶液。10 mmol/L EDTA 和 1 g/L 叠氮化钠的终质量浓度为 2 μg/mL。将 7 mm×300 mm 玻璃纤维(Millipore，MA，USA)浸入共轭溶液中，制成共轭垫，然后在 56 ℃下干燥 1 h。样品垫和吸收垫是由无纺布的 100%纯纤维素制成的[25,28]。使用切割机将主卡切成 3 mm宽的条。然后将条带在干燥剂凝胶存在的情况下密封在塑料袋中，并保存在 4 ℃下。

　1.8 测试程序和原则 牛奶样品在 5 000 r/min 下离心 15 min 以去除脂肪。将一块测试条插入 80 μL 标准样品中 10 s，然后将其平放以使溶液迁移。胶体金标记的抗 TYL mAb 被固定在膜上的 BSA-TYL 捕获，形成一条清晰的红色测试线。过量标记的抗 TYL mAb 进一步迁移并被形成对照系的山羊抗小鼠 IgG 抗体捕获，完成测试需要 10 min。如果样品中存在 TYL，它将与测试线上的固定 BSA-TYL 竞争，以结合有限量的胶体金标记的抗 TYL mAb(图 1)。

　图 1 胶体金免疫层析试纸条检测原理示意图[29] Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of colloidal gold immunochromatographic test strips[29] 1.9 统计分析 使用统计软件 SPSS 11.0 和数据处理系统 14.0(data processing system，DPS)进行统计[30]。数值表示为平均值±标准差。所有数据均适用于分析，无需任何转换。

　2 结果与分析 2.1 mAb 对 TYL 的影响 通过 ELISA 法评估了针对 TYL 的单克隆抗体 mAb 对 TYL 的影响。抗体效价表示为最大稀释度的倒数，最大稀释度产生的 OD450 值比阴性对照高 2.1 倍。结果表明，抗体效价为 2.56×10-5(图 2)。将 IC50(IC50是捕获在测试线上的胶体金标记的抗 TYL mAb 50%抑制的浓度。交叉反应性表示为竞争者的 IC50 浓度除以 TYL 的百分比)评估为 50%测试抑制率下的 TYL 浓度。结果表明，IC50 为 4.609 1 ng/mL。通过用PBS 稀释 TYL 来建立 ELISA 的标准抑制曲线(图 3)。

　图 2 抗 TYL 抗体滴度 Fig.2 Anti-TYL antibody titer 注：NC 为阴性对照 图 3 icELISA 的抑制曲线 Fig.3 Inhibitory curves by icELISA 注：标准曲线的标准质量浓度为 1、2、4、8、16、32 ng/mL, 以标准样品取对数计算 2.2 试纸的灵敏度 通过测试 TYL 标准样品来预测试纸条的灵敏度。用读数仪扫描检测线。G/Peak 和 G/D×相对光密度(relative optical density，ROD)的面积随着标准样品中 TYL 浓度的增加而降低(图 4 和表 1)。

　使用无污染牛奶测定了检出限(limit of detection，LOD)。LOD 以阴性样品 20 次测定结果的平均值加 3 倍标准偏差计算。与阴性对照

　(NC)相比，LOD 对应于 G/D×Area-ROD 下降 10%的浓度。结果表明，使用扫描仪计算出的 LOD 为 1.563 4 ng/mL，而使用眼睛计算出的 LOD为 10 ng/mL。计算其 IC50 为 7.836 2 ng/mL。

　图 4 标准样品的 ROD 曲线 Fig.4 ROD curves of standard samples 注：使用测试条测试了 0、2、4、8、16、32、64 ng/mL 的标准 TYL样品； 用 TSR3000 膜条读取器扫描测试线(309 mm×188 mm，分辨率72×72) 表 1 G/Peak 和 G/D×标准样品测试线的 ROD 面积 Table 1 G/Peak and G/D×Area of the ROD of test lines of standard samples 2.3 试纸的特异性 根据四参数对数方程，抗 TYL mAb 对 TYL 和其他兽药的 IC50 和反应性如表 2 所示。计算得出 TYL 的 IC50 为 7.836 2 ng/mL，而其他兽药(包括替米考星、螺旋霉素、交沙霉素、罗红霉素、红霉素、阿奇霉素、磺胺甲氧二嗪、克仑特罗、链霉素和莱克多巴胺)IC50 值均 3 000 ng/mL。近年来，许多研究人员开发了 ELISA 方法来检测动物尿液和组织中的 TYL[5,31-32]。众所周知，这种方法至少需要 3～4 h 才能完成。相反，本发明的免疫层析侧流试纸条是一步测定，需要的专业人员和实验仪器少得多。此外，就潜在的交叉反应性而言，与检测TYL 残基的多克隆抗体相比，单克隆抗体似乎是更好的解决方案。

　2.4 试纸和 HPLC 之间的比较研究

　作为比较任务，HPLC 分析[27]被用作鉴定和定量牛奶中 TYL 的确认方法。从河南省的 10 个农场中随机抽取 10 个有代表性的测试样品。结果如表 3 所示。与 HPLC 检测相比，期望的最小符合率 15%。

　表 2 抗 TYL 单抗与其他兽药的反应性 Table 2 Reactivity of anti-TYL mAb with other veterinary drugs 尽管发现 HPLC、ELISA 和试纸条都适合分析生物样品中的 TYL 残留，但 ELISA 和试纸条更为灵敏。当样品中存在高浓度的 TYL 时，HPLC和试纸条给出的结果一致或几乎相同，而当样品中存在低浓度的 TYL时，其读数却不同(表 3)。原因是 TYL 的量已达到定量极限。在 TYL浓度低于HPLC定量限的条件下，测试条是分析TYL残留的更好选择。

　表 3 用试纸条和 HPLC 分析检测牛奶中 TYL 残留的测试结果比较 Table 3 Comparison of testing results with test strips and HPLC analysis for detection of TYL residues in milk 3 结论 本文以牛奶中的 TYL 为免疫原，成功开发了使用 TYL 特异性 mAb 的侧流胶体金免疫层析试纸条。通过和 HPLC、ELISA 检测方法的比较，发现试纸的 LOD 为 1.563 4 ng/mL,IC50 为 7.836 2 ng/mL，与 ELISA的检测结果有良好的符合率，该指标完全可以满足国家的最低标准要求。结果表明，它对牛奶样品中 TYL 残留的检测具有很高的特异性和灵敏度。特别是，无需特殊设备，即可在 20 min 内获得结果。综上所述，这种牛奶中的 TYL 快速检测方法，对于牛奶饮用安全性提供了保障。